使用Seurat进行聚类和注释

本教程演示如何对预处理的Seurat对象进行聚类，然后使用CASSIA对结果细胞簇进行注释。我们假设质量控制步骤已经完成。

1. 安装和设置

1.1 所需软件包

# 安装所需软件包
install.packages(c("Seurat", "dplyr", "reticulate", "devtools"))

# 从GitHub安装CASSIA
library(devtools)
devtools::install_github("ElliotXie/CASSIA/CASSIA_R")

# 加载软件包
library(Seurat)
library(dplyr)
library(CASSIA)

# 设置API密钥（CASSIA运行所需）
setLLMApiKey("your_api_key", provider = "openrouter", persist = TRUE)  # 或使用anthropic/openai
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2. 探索预处理的Seurat对象

在本教程中，我们将使用GTEX项目的乳腺组织数据集作为示例。该数据集为乳腺组织细胞类型提供了全面的参考，可从以下链接下载：

GTEX乳腺组织数据集

# 加载GTEX乳腺数据集
gtex_data <- readRDS("gtex_ref.rds")

# 查看数据集元数据
gtex_data@meta.data %>% colnames()
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[1] "orig.ident" "nCount_RNA" "nFeature_RNA" "Broad.cell.type" "Granular.cell.type"

我们可以看到数据集在 Broad.cell.type 和 Granular.cell.type 列中包含金标准细胞类型标签。

3. 降维和聚类

3.1 PCA和UMAP

gtex_data <- NormalizeData(object = gtex_data)
gtex_data <- FindVariableFeatures(object = gtex_data)
gtex_data <- ScaleData(object = gtex_data)
gtex_data <- RunPCA(object = gtex_data)
gtex_data <- FindNeighbors(object = gtex_data, dims = 1:25)     # 使用25个主成分进行聚类
gtex_data <- FindClusters(object = gtex_data,resolution = 0.4)  # 使用分辨率0.4进行聚类
gtex_data <- RunUMAP(object = gtex_data, dims = 1:25)           # 使用25个主成分进行UMAP
DimPlot(object = gtex_data, reduction = "umap")                # 可视化UMAP
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3.3 发现标记基因

Idents(gtex_data)="RNA_snn_res.0.4" # 如果使用默认分辨率0.4，这是默认的细胞簇列名

all_markers <- FindAllMarkers(gtex_data,
                              only.pos = TRUE)

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标记基因过滤在CASSIA内部实现，且注释增强代理也需要原始标记文件；因此，此步骤无需进行过滤。

4. 使用CASSIA注释细胞簇

4.1 基础注释

现在我们有了细胞簇和标记基因，可以使用CASSIA进行注释：

results <- runCASSIA_pipeline(
    output_file_name = "gtex_breast_annotation",
    tissue = "Breast",
    species = "Human",
    marker = all_markers,
    max_workers = 6  # 取决于您的CPU核心数
)

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默认提供商是OpenRouter，默认模型已优化以获得最佳注释质量。要查看每个新模型的表现，请访问我们的基准测试网站：

sc-llm-benchmark.com/methods/cassia

流水线创建一个名为 CASSIA_Pipeline_{tissue}_{species}_{timestamp}/ 的输出文件夹，包含三个子文件夹：

• 01_annotation_report/ - 分析的交互式HTML报告
• 02_annotation_boost/ - 低评分细胞簇的注释增强结果
• 03_csv_files/ - 汇总CSV文件，包括最终结果

最终结果CSV文件：

4.2 将注释整合到Seurat对象

运行CASSIA后，您可以将注释整合回Seurat对象：

seurat_breast=add_cassia_to_seurat(
    seurat_obj = gtex_data,
    cassia_results_path = "CASSIA_Pipeline_Breast_Human_XXXXXX/03_csv_files/gtex_breast_annotation_FINAL_RESULTS.csv", # 将XXXXXX替换为实际时间戳
    cluster_col = "RNA_snn_res.0.4", # Seurat对象中用于FindAllMarkers的细胞簇列名
    columns_to_include = 1) # 默认仅导出合并列回seurat，设置为2可导出所有列
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4.3 可视化注释

DimPlot(seurat_breast,group.by = "Broad.cell.type", label = TRUE, repel = TRUE)
DimPlot(seurat_breast,group.by = "Granular.cell.type", label = TRUE, repel = TRUE)
DimPlot(seurat_breast,group.by = "RNA_snn_res.0.4", label = TRUE, repel = TRUE)
DimPlot(seurat_breast,group.by = "CASSIA_merged_grouping_1", label = TRUE, repel = TRUE)
DimPlot(seurat_breast,group.by = "CASSIA_merged_grouping_2", label = TRUE, repel = TRUE)
DimPlot(seurat_breast,group.by = "CASSIA_merged_grouping_3", label = TRUE, repel = TRUE)

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CASSIA会自动将注释汇总为三个不同的详细级别，从最概括到最详细，如UMAP图所示。

5. 后续步骤

完成聚类和注释后：

• 对主要细胞簇进行子集划分并重复上述步骤
• 使用 runCASSIA_annotationboost() 处理注释质量较低的细胞簇
• 尝试 compareCelltypes() 区分相似的细胞类型
• 探索 runCASSIA_subclusters() 对特定细胞群体进行更详细的分析
• 实施 runCASSIA_batch_n_times() 进行不确定性量化

有关更全面的质量控制和分析技术，请参阅"完整工作流程最佳实践"教程。